爱奇飞网

网站首页健康养生 >正文

揭示环状β-1,2-葡聚糖合酶的环化机制

开心的月饼 2024-03-07 08:41:06 健康养生

多糖β-1,2-葡聚糖由通过β-1,2-糖苷键连接在一起的葡萄糖重复单元组成。环状 β-1,2-葡聚糖 (CβG) 存在于不同的细菌物种中,在细菌感染和共生关系中发挥作用。CβG 生物合成由环状 β-1,2-葡聚糖合酶 (CGS) 催化,CGS 是一种催化线性 β-1,2-葡聚糖 (LβG) 环化(闭环形成)的酶。

揭示环状β-1,2-葡聚糖合酶的环化机制

由于大规模酶法合成线性β-1,2-葡聚糖的方法已经建立,将其与该酶结合用于高效一锅法合成环状β-1,2-葡聚糖在技术上是可行的。但该酶的环化活性不是很强,而且作为酶的稳定性也较低。

先前的研究表明,葡萄糖与 CGS 的键合、LβG 链的延长、葡聚糖链长度的调整和葡聚糖的环化分布在 CGS 的三个不同域中。然而,虽然已知 CGS 中部区域的酶结构域会环化 LβG,但迄今为止,科学家们仍不清楚该过程的详细机制。

最近,来自日本的一组研究人员通过对意大利热厌氧杆菌(TiCGS Cy)的CGS环化结构域进行功能和结构分析,揭示了CGS环化的催化机制。该团队由东京理科大学(TUS)应用生物科学系助理教授 Nobukiyo Tanaka 领导,成员包括 Br. 来自启迪科技大学的 Ryotaro Saito、副教授 Masahiro Nakajima 和 Tomoko Masaike 副教授,以及来自新泻大学的 Hiroyuki Nakai 副教授和来自日本产业技术综合研究所 (AIST) 的 Kaito Kobayashi 博士。

他们的研究结果发表在《应用微生物学和生物技术》杂志上。

Tanaka 博士阐述道:“从生理学角度来看,CGS 是重要的酶,因为 CβG 与各种细菌疾病和共生关系有关。我们热衷于提供有关 CGS 结构和功能的见解,这些在研究中受到关注,但目前尚未得到证实。 β-1,2-葡聚糖环化的机制仍然是个谜。”

研究的第一步涉及在大肠杆菌中单独表达环化结构域 TiCGS Cy作为重组酶。

表征的下一步涉及分析当 LβGs 用作 TiCGS Cy的底物时的反应产物。“我们发现 TiCGS Cy产生了 β-葡萄糖苷酶抗性化合物。在使用核磁共振波谱检查它们时,我们发现了 CβG。这是 TiCGS Cy产生 CβG的第一个证据,”Tanaka 博士解释道。

为了确定 TiCGS Cy对 LβG的作用模式,研究小组用 β-1,2-葡萄糖寡糖(包含 2-10 个葡萄糖单位的 LβG)处理 TiCGS Cy并分析产物。反应产物表明,TiCGS Cy机制缺乏水解反应,具有转糖基作用,并且需要长度至少为六糖(六个或更多葡萄糖单元的聚合物)的底物。

这一发现与之前研究的数据相匹配,之前的研究中相关 CGS 产生的 CβG 具有约 20 个葡萄糖单元的聚合物。最后,有人认为 TiCGS Cy具有端基异构体保留机制,因为它生成与其底物具有相同端基异构体的产物。

此外,使用X射线晶体学对TiCGS Cy进行结构分析表明,TiCGS Cy与来自Chitinophaga pinensis(CpSGL,属于GH144)和真菌Talaromyces funiculosus(TfSGL,属于GH162)的β-1,2-葡聚糖酶在结构上相似,虽然它们的氨基酸序列同源性很低。

将CpSGL(GH144)的配合物结构、TfSGL(GH162)的米氏配合物结构和TiCGS Cy的整体结构叠加,探索TiCGS Cy的催化残基。

结果发现,E1356位于通过+2位点葡萄糖分子的3-OH基团作用于裂解位点糖苷键氧原子的位置,而E1442位于直接进行裂解位点的位置。对亚位点 –1 的异头中心进行亲核攻击。因此,推测它们分别是一般酸/碱和用于催化的亲核残基。

TiCGS Cy的详细反应机理如下:

(a) E1356 充当催化的通用酸,通过葡萄糖分子 +2 子位点的 3-OH 基团向氧原子提供质子。同时,E1442 作为亲核试剂,攻击子位点 –1 的异头中心,形成糖基酶中间体。

(b) E1356 充当通用碱,通过 +2 子位点葡萄糖分子的 3-OH 基团从 +1 子位点葡萄糖分子的 2-OH 基团吸引质子。

(c) 子位点 +1 处的活化 2-OH 基团攻击子位点 –1 处的异头碳,释放糖基转移产物。

在上述反应中,表明当来自与形成糖基-酶中间体的分子不同的分子的羟基攻击(a)中的异头碳原子时,获得直链产物。相反,当攻击羟基来自同一分子时,形成环状产物。

总的来说,这些发现对于 TiCGS Cy的表征具有重要意义。“鉴于其非规范反应机制,该 CGS 定义了一个新的糖苷水解酶家族 GH189,”Tanaka 博士说。

总之,通过这项研究,研究人员确定了对环化活性重要的残基,从而有望寻找具有更强环化活性和更高稳定性的酶。该团队相信他们的工作将为探索 CGS 的抑制开辟研究途径。


版权说明:本站所有作品图文均由用户自行上传分享,仅供网友学习交流。若您的权利被侵害,请联系我们


标签:

站长推荐
栏目推荐
阅读排行