费城儿童医院(CHOP)的研究人员开发了一种多功能且低成本的全长RNA分子靶向测序技术，这项技术可以加速新诊断和治疗方法的发现。该技术名为TEQUILA-seq，与商业化的靶向RNA测序解决方案相比，具有极高的成本效益，并且可适用于不同的研究和临床目的。NatureCommunications的一篇论文描述了详细信息。

在从基因到蛋白质的过程中，RNA分子在被翻译成蛋白质之前可以通过不同的方式进行切割和连接。这个过程被称为选择性剪接，它允许单个基因编码几种不同的蛋白质。尽管选择性剪接发生在许多生物过程中，但它可能在癌症等疾病中失调，导致致病性RNA分子的产生。为了了解选择性剪接如何导致疾病，研究人员需要准确计算源自单个基因的所有RNA分子(称为“转录亚型”)。

其中一种方法是使用“长读长”RNA测序平台，该平台对长度超过10,000个碱基的RNA分子进行端到端测序，捕获完整的转录异构体。然而，这些长读长平台的测序产量不大，这阻碍了它们的广泛采用，尤其是在临床环境中，因为在临床信息深度上生成长读长RNA测序数据可能非常昂贵。靶向测序涉及在测序之前富集感兴趣的特定核酸序列，是一种有用的策略，可以显着增强预定义靶标的覆盖范围，但靶标捕获的成本和复杂性一直是广泛使用的障碍。

“靶向长读长RNA测序是一种强大的策略，可用于阐明任何预定义基因组的RNA库。然而，现有的全长RNA分子靶向测序技术要么价格昂贵，要么难以建立，这使得它们遥不可及。对于许多实验室来说，”共同资深作者、病理学和实验医学助理教授、CHOPRaymondG.Perelman细胞和分子治疗中心成员LanLin博士说。“TEQUILA-seq解决了这个问题，既便宜又易于使用。用户可以根据不同的目的调整该技术，研究人员可以选择他们想要测序的基因，并在自己的实验室中制作用于目标捕获的试剂。

一种允许靶向测序的方法称为基于杂交捕获的富集，该方法使用称为寡核苷酸的短核酸片段作为捕获探针。这些寡核苷酸(通常简称为“寡核苷酸”)带有生物素分子标记，并设计为基于核酸序列互补性与其靶标杂交，从而可以轻松地从生物样品中捕获和分离其靶序列。然而，虽然基于杂交捕获的富集是一种有效的靶向测序方法，但商业合成的生物素化捕获探针价格昂贵，并且只能用于有限数量的反应，使得每个捕获反应的每个样品的成本很高。

为了解决这一限制，CHOP研究人员开发了TEQUILA-seq(利用等温线性扩增探针结合长读长测序进行转录富集和定量)。TEQUILA-seq的一项关键创新是切口核酸内切酶触发的等温链置换扩增反应，该反应可以从廉价的非生物素化寡核苷酸库作为模板合成大量生物素化捕获探针。只需输入2ng模板寡核苷酸，研究人员就可以生成25ugTEQUILA探针，可用于至少250个捕获反应。这种合成捕获探针的创新策略使得TEQUILA-seq对于大型目标面板和许多生物样品具有极高的成本效益和可扩展性。

为了对其性能进行基准测试，研究人员对合成RNA或人类RNA的多个基因组进行了TEQUILA-seq。TEQUILA探针在目标捕获和富集方面的表现与商业捕获探针一样，同时每个捕获反应的成本要低数百倍。此外，研究人员证明TEQUILA-seq可以显着增强检测，同时保留目标RNA分子的定量。

“使用廉价的试剂和简单的实验工作流程，TEQUILA-seq使我们能够对许多生物样本中任何基因组的全长RNA分子进行深入测序，”该中心主任、共同高级作者YiXing博士说。CHOP的计算和基因组医学。“这非常令人兴奋，并且能够实现从RNA引导的基因诊断到治疗开发等广泛的医学应用。”

为了说明其生物医学用途，研究人员应用TEQUILA-seq分析了40个乳腺癌细胞系中468个可作用癌症基因的全长RNA分子。他们在广泛研究的癌症基因中发现了以前未知的转录亚型，这可能有助于揭示保护身体免受癌症侵害的基因如何在个体肿瘤中失活。

“我们的工作表明TEQUILA-seq可广泛用于全长RNA分子的靶向测序，”Lin博士说。“此外，TEQUILA探针是通用捕获探针。它们兼容长读长和短读长测序平台上的靶向RNA和DNA测序。能够为任何目标组轻松生成大量生物素化捕获探针低成本且轻松地可以促进许多基础、转化和临床应用的大规模和人群水平研究。”

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