当今大多数批准的基因疗法，包括那些涉及CRISPR-Cas9的基因疗法，都对从体内取出的细胞发挥作用，然后将编辑后的细胞送回患者体内。

这项技术非常适合靶向血细胞，目前是新批准的CRISPR基因疗法用于治疗镰状细胞性贫血等血液疾病的方法，其中编辑的血细胞在骨髓被化疗破坏后被重新输注到患者体内。

一种新的、精确靶向的CRISPR-Cas9递送方法发表在《自然生物技术》杂志上，可以在体内对非常特定的细胞子集进行基因编辑——这是朝着可编程递送方法迈出的一步，该方法将消除消除患者的需要'骨髓和免疫系统在给它们编辑血细胞之前。

这种递送方法是由CRISPR-Cas9基因组编辑联合发明人JenniferDoudna的加州大学伯克利分校实验室开发的，涉及将Cas9编辑蛋白和引导RNA包裹在装饰有单克隆抗体片段的膜泡中专注于特定类型的血细胞。

作为演示，创新基因组研究所(IGI)杜德纳实验室的CRISPR研究员JenniferHamilton将免疫系统的一个细胞(T细胞)作为目标，这是称为嵌合抗原受体的革命性癌症治疗的起点(CAR)T细胞疗法。

Hamilton和她的同事对配备了人源化免疫系统的活小鼠进行了治疗，并将它们的人类T细胞转化为CART细胞，能够瞄准并消除另一类免疫细胞(B细胞)。

汉密尔顿说，这一壮举是一个原理证明，显示了使用这种载体方法(包膜运输工具)来靶向和编辑活体动物(体内)以及最终人类中的血细胞和潜在其他类型细胞的潜力。

汉密尔顿说：“我们的方法涉及多重靶向分子，也就是说，我们的粒子上有两个或多个靶向分子，它们与目标细胞相互作用，有点像计算机中的与门。”他指的是仅在两个事件发生时才运行的逻辑电路同时地。

“当颗粒通过两种抗体配体相互作用结合时，我们能够获得更有效的递送。用T细胞靶向载体治疗小鼠后，我们在我们感兴趣的细胞类型T细胞中观察到基因组工程，而不是在肝细胞中”。

她说，对于所有将基因传递到细胞中的方法来说，高度特异性的靶向都是困难的。尤其是肝细胞，通常会占用定向到其他地方的运载工具。

病毒包膜

汉密尔顿和她的团队正在研究提供基因疗法的几种实验技术之一。许多病毒使用封装病毒的外层——病毒被清空并填充校正转基因或基因编辑工具，如CRISPR-Cas9。

其他方法，包括IGI研究人员正在探索的一种方法，依赖于直接将细胞穿透性Cas9蛋白注射到小鼠体内来实现基因组编辑。

汉密尔顿在攻读博士学位时研究了流感等包膜病毒，她专注于改造这类病毒，因为它们有更灵活的外层，由它们出芽的细胞的外膜组成。

在2021年的一篇出版物中，她证明了HIV-1病毒的外部包膜已被掏空并充满Cas9，她称之为病毒样颗粒(VLP)，可以在培养物中(离体)编辑T细胞，并且将它们转化为CART细胞。从那时起，她对病毒包膜进行了如此大的改变，以至于她现在将它们称为包膜运输工具(EnvelopeedDeliveryVehicle，EDV)。

EDV的一个关键方面是其外膜可以很容易地用多个抗体片段或靶向配体装饰，这大大提高了靶向特异性。其他基因传递载体，例如腺相关病毒和脂质纳米颗粒，已被证明更难精确靶向。

汉密尔顿说：“人们正在努力重新定位所有这些载体，使其对一种细胞类型具有特异性，并使它们不再靶向传递到其他细胞类型。”

“你可以展示抗体或抗体片段，就像我们一直在做的那样，但旁观者细胞的摄取仍然相当高。你可以将递送偏向一种细胞类型，但你仍然可以观察到旁观者细胞的摄取。在我们的研究中，“在论文中，我们实际上检查了肝脏，看看我们是否出现脱靶传递，但没有发现任何情况。我认为，使用更传统的无包膜病毒载体或脂质纳米颗粒来实现这一目标将更具挑战性。”

在这篇论文中，Hamilton和她的同事试图在体内复制2020年《科学》杂志报道的一种成功用于癌症患者的离体CRISPRCART细胞疗法。该疗法不仅传递了针对癌细胞的受体的转基因，而且还使用CRISPR敲除不针对癌症的受体。

加州大学伯克利分校的研究人员成功敲除天然T细胞受体，并为靶向B细胞(癌细胞的代表)的受体提供转基因。由于Cas9蛋白与转基因一起在同一EDV内传递，因此它的寿命比传递Cas9基因的方法更短，这意味着脱靶编辑更少。

汉密尔顿说：“我们在这篇论文中试图实现的目标是跳过在体外改造细胞的整个步骤。我们的目标是系统地施用单一载体，该载体可以在特定的情况下进行基因传递和基因敲除。我们使用这种递送策略在体内制造基因编辑的CART细胞，希望能够简化用于离体制造基因编辑的CART细胞的复杂过程。”

Doudna和她的实验室继续提高EDV介导的传递效率。汉密尔顿曾是杜德纳实验室的博士后研究员，作为IGI女性进取科学项目的研究员，正在进一步开发这种交付方法。

该实验室专注于体内发挥作用的载体的最终原因是为了使CRISPR疗法更广泛可用且更便宜。在《连线》杂志最近发表的一篇文章中，杜德纳提到了当今昂贵的基因疗法的不公平性，部分原因是患者接受骨髓移植时需要延长住院时间。

“镰状细胞病的治疗预计每位患者的费用将超过200万美元，而美国只有少数机构具备提供这种治疗的技术能力，”杜德娜(Doudna)因她的同事分享了2020年诺贝尔化学奖而写道。-CRISPR-Cas9基因组编辑技术的发明。

“允许在体内提供基因编辑疗法和改进制造的新技术将是压低价格的关键，大学、政府和行业之间的独特合作伙伴关系也将成为共同目标，并将可负担性作为共同目标。仅仅使价格下降是不够的。工具。我们必须确保它们到达最需要它们的人手中。”

除了Hamilton和Doudna之外，该论文的其他合著者还有EvelynChen、BarbaraPerez、CindySandovalEspinoza、MinHyungKang和MarenaTrinidad(均隶属于IGI和加州大学伯克利分校分子和细胞生物学系)以及WayneNgo旧金山格拉德斯通研究所。

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