在《TheCRISPRJournal》上发表的一项新研究中，Collins和他的同事将这两条链结合在一起，描述了一种新的工作流程，使用Prime编辑在诱导多能干细胞(iPSC)中生成特定的单碱基变体，并在T2D研究中具有特定的应用。

这项工作的详细信息发表在题为“GenerationofHumanIsogenicInducedPluripotencyStemCellLineswithCRISPRPrimeEditing”的论文中。根据该论文，该团队设计并优化了一种基于CRISPR的初等编辑方案，用于工程干细胞系，并用它生成了27个iPSC系，这些iPSC系携带与T2D风险相关的六种因果单核苷酸变异(SNV)的杂合和纯合等位基因。

先前的研究已将许多环境和遗传因素与T2D的发展联系起来。大型关联研究发现了数百种与糖尿病相关的基因变异(超过1,200种关联)，但尚不清楚哪些变异是因果关系，哪些只是旁观者。个体遗传背景的差异也使得识别和优先考虑最重要的变异变得具有挑战性。

NHGRI分子遗传学部门的科学家LoriBonnycastle博士表示，Prime编辑是回答此类问题的有效工具，因为它使柯林斯实验室能够对DNA进行精确编辑，并探索这些变化与特定表型之间的联系。该论文的主要作者。例如，他们可以对不同iPSC系中的同一位置进行三次编辑，在β细胞中区分它们，然后评估个体变化对表型的影响。

但主要编辑仍处于起步阶段，有许多因素需要考虑，过程中的许多点可能会出错，而且编辑组件有时可能无法高效工作。例如，编辑目标碱基周围的序列类型有时会限制编辑装置的效率。

邦尼卡斯尔说，她的团队的研究目标相对较小。他们的目标是使用足以生成可用于功能性疾病研究的细胞模型的初等编辑来优化细胞编辑过程。“Prime[编辑]非常精确，很多人都在研究它，因为它具有巨大的潜力，”她告诉GEN。我们的协议“使我们能够足够接近地构建我们需要的工具。而且它可以应用于其他实验室。”

克服挑战

Collins实验室代表了大约两年来优化iPSC中单碱基变化的主要编辑的研究，在很大程度上克服了一些长期存在的技术挑战。开发最佳方案需要改变多个参数，然后测试结果。例如，他们使用pegRNA和sgRNA寡核苷酸的不同组合来修饰碱基。

Bonnycastle说：“我们还考虑了如何将[编辑组件]真正放入细胞中，以及是否要将[它们]以质粒的形式放入，或者以实际上可以在细胞中自我复制的形式放入。”细胞。”他们还重新设计了用于研究的pegRNA，以提高其效率。

他们的协议还包括多个测序步骤，旨在检查编辑过程的效率。具体来说，转染后，他们使用下一代测序来筛选合并的细胞，以找到具有最多编辑等位基因的样本。仅使用编辑后的细胞池继续前进可以减少下一步所需的工作量。接下来，他们使用桑格测序来评估单个克隆，以找到具有正确感兴趣编辑的克隆。最后，根据现有研究的证据，他们只关注了数百个变体中的六个变体，这些证据表明它们在T2D背景下很可能是偶然的。

“该管道的每个部分都经过[优化]以减少工作量，”邦尼卡斯尔说。“干细胞生长得不太快，所以你不想花太多时间在不起作用的事情上。我们的想法是选择最好的池，深入研究这些池，然后培养这些细胞以找到那些进行编辑的池。”

值得注意的是，该团队并未测试实验参数的所有可能变化，而是选择在达到可接受的编辑效率后停止测试排列。他们写道：“各种prime编辑系统组件和pegRNA设计的编辑效率是在一种转染设置下实现的，这意味着它们“可能无法完全优化，无法为每个测试的prime编辑变量产生最佳结果。”

并不是所有的组合都有效。Bonnycastle指出，该团队设计的一些pegRNA未能产生功能性细胞系，但他们没有尝试一些选择。“我们以后可能会做更多，但这就是我们现在的处境，”她说。

根据CRISPRJournal论文，科学家们能够获得36%的编辑效率，在某些品系中高达70%以上。他们的协议还缩短了等待研究就绪模型的时间。科学家们能够在4-5周内从使用初等编辑组件的iPSC转染到经过验证的编辑多能克隆。

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