甲烷氧化菌每年消耗3000万吨甲烷，其将强效温室气体转化为可用燃料的天然能力吸引了研究人员。然而，我们对复杂反应如何发生知之甚少，这限制了我们利用双重利益为我们带来优势的能力。通过研究细菌用来催化反应的酶——颗粒甲烷单加氧酶(pMMO)，西北大学的一个团队现在发现了可能驱动这一过程的关键结构，并表明他们的发现最终可能导致人类的发展-制造将甲烷气体转化为甲醇的生物催化剂。

该团队在《科学》杂志上发表的论文的高级作者、西北大学的艾米·罗森茨威格博士说：“如果我们不确切地了解酶如何进行这种困难的化学反应，我们将无法针对生物技术应用对其进行设计和优化。”。“甲烷具有非常强的键，所以有一种酶可以做到这一点是非常了不起的......如果你想优化酶以将其插入生物制造途径或消耗甲烷以外的污染物，那么我们需要知道它是什么样的在它的原生环境和甲烷结合的地方……你可以使用带有工程酶的细菌从水力压裂现场收集甲烷或清理石油泄漏。”

Rosenzweig及其同事在题为“脂质双层中颗粒甲烷单加氧酶结构和活性的恢复”的论文中描述了他们的研究和结果。罗森茨威格是西北大学温伯格艺术与科学学院的温伯格家族生命科学杰出教授，她在分子生物科学和化学领域担任职务。

研究小组解释说，科学家们已经设计了甲烷氧化菌来生产一系列产品，但产量低和转化效率低意味着这些过程在经济上不可行。“要使甲烷生物转化具有变革性，必须优化第一步——将甲烷氧化为甲醇——这需要在分子水平上了解负责的主要酶颗粒甲烷单加氧酶(pMMO)。”研究人员进一步指出：“该酶包含PmoA(β)、PmoB(α)和PmoC(γ)，排列为αβγ原聚体的三聚体。”“来自多种甲烷氧化物种的去污剂溶解的pMMO的晶体结构揭示了三个铜结合位点的存在。”

然而，pMMO(一种铜依赖性酶)是一种特别难以研究的蛋白质，因为它嵌入细菌细胞膜中。通常，当研究人员研究甲烷氧化细菌时，他们会使用一种严酷的过程，使用洗涤剂溶液将蛋白质从细胞膜上撕下来。虽然这个过程有效地分离了酶，但它也杀死了所有酶的活性，并限制了研究人员可以收集的信息量——比如在没有心跳的情况下监测心脏。“pMMO活性在洗涤剂溶解后降低，纯化的样品表现出零甲烷氧化活性，这意味着这些结构不代表活性酶，”科学家评论道。“使用无活性、去污剂溶解的pMMO确定的晶体结构缺乏与拟议活性位点邻近的几个保守区域。”

研究小组特别解释说，对于任何pMMO晶体结构，PmoC亚基内的大约25个残基在电子密度图中丢失。这些残基对应于PmoC序列中最高度保守的部分，预计位于关键的铜结合位点附近。研究小组表示：“该区域的模糊性阻碍了对甲烷和氧气结合的任何潜在空洞的识别。”“这两个限制——PmoC活性的丧失和紊乱——很可能都是由于pMMO从其天然膜环境中去除所致。”研究小组推断，脂质双层的破坏以及去污剂溶解和纯化步骤可能会导致构象变化，从而导致任何结合的金属和/或脂质辅助因子的分离。

在新报告的研究中，该团队使用了一种全新的技术来研究pMMO。第一作者ChristopherKoo是Rosenzweig实验室的博士生，他想知道通过将酶放回类似于其原生环境的膜中，他们是否可以学到新的东西。Koo使用细菌中的脂质在称为纳米圆盘的保护性颗粒内形成膜，然后将酶嵌入该膜中。

研究人员使用了冷冻电子显微镜(cryo-EM)，这种技术非常适合研究膜蛋白，因为脂质膜环境在整个实验过程中不受干扰。他们的方法使他们首次能够以高分辨率可视化活性酶的原子结构。“通过在纳米圆盘内重建酶的天然环境，我们能够恢复酶的活性，”Koo说。“然后，我们能够使用结构技术在原子水平上确定脂质双层如何恢复活性。通过这样做，我们发现了酶中可能发生甲烷氧化的铜位点的完整排列。”

Rosenzweig补充道：“由于最近冷冻电镜的‘分辨率革命’，我们能够看到原子细节的结构。我们所看到的完全改变了我们对这种酶活性位点的思考方式。”作者进一步解释说：“通过冷冻电子显微镜以2.14至2.46埃的分辨率测定多个纳米圆盘嵌入的pMMO结构，揭示了脂质环境中pMMO的结构。所得模型包括稳定脂质、先前结构中未观察到的PmoA和PmoC亚基区域，以及PmoC亚基中先前未检测到的铜结合位点以及相邻的疏水腔。

“这些活性pMMO的第一个结构是通过将酶嵌入天然脂质双层中获得的，为pMMO结构和功能提供了重要的见解，”作者进一步指出。“经过超过15年的晶体学表征，我们对pMMO的观点进行了重大修改，强调了在天然环境中研究膜蛋白的重要性以及高分辨率冷冻电镜与膜模拟技术相结合的潜力。”

Rosenzweig表示，冷冻电镜结构为回答不断出现的问题提供了一个新的起点。甲烷如何到达酶活性位点?或者甲醇从酶中逸出?活性位点的铜是如何进行化学反应的?“这些结构为理解和设计pMMO功能提供了一个修订后的框架，”作者表示。

接下来，该团队计划使用一种称为冷冻电子断层扫描(cryo-ET)的前沿成像技术直接研究细菌细胞内的酶。如果成功，研究人员将能够准确地看到酶在细胞膜中的排列方式，确定它在真正的天然环境中如何运作，并了解酶周围的其他蛋白质是否与其相互作用。这些发现将为工程师提供一个关键的缺失环节。

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