格拉德斯通研究所和加州大学旧金山分校(UCSF)的科学家表示，他们已经采用CRISPR-Cas9系统来强制激活人类免疫细胞中的基因，而不是编辑它们。研究人员表示，这种被称为CRISPRa的方法可以让他们比以前更彻底、更快速地发现在免疫细胞生物学中发挥作用的基因。

“这是一个令人兴奋的突破，将加速免疫治疗研究，”格莱斯顿-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所所长、这项新研究的资深作者AlexMarson医学博士说。“这些CRISPRa实验创造了罗塞塔石碑，用于了解哪些基因对免疫细胞的每项功能都很重要。反过来，这将为我们提供如何从基因上改变免疫细胞的新见解，从而使它们能够成为癌症和自身免疫性疾病的治疗方法。”

这项研究(“CRISPR激活和干扰筛选解码原代人类T细胞的刺激反应”)发表在《科学》杂志上，据报道，这是第一个在原代人类细胞中成功大规模使用CRISPRa的研究，这些细胞是直接从个体中分离出来的细胞。

该团队激活了不同细胞中基因组中的每个基因，使他们能够并行测试近20,000个基因。这使他们能够快速了解​​哪些基因提供最强大的杠杆来重新编程细胞功能，从而最终导致更强大的免疫疗法。

“人类T细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对于健康的免疫功能至关重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌症中失调。对通过功能获得和功能丧失基因扰动协调T细胞激活的调节因子的系统理解将为疾病途径提供更多见解，并为设计下一代免疫疗法提供更多机会，”研究人员写道。

“尽管CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR干扰(CRISPRi)筛选是永生化细胞系功能获得和功能丧失研究的强大工具，但在原代细胞类型中大规模部署它们一直具有挑战性。在这里，我们在原代人类T细胞中开发了CRISPRa和CRISPRi发现平台，并对响应刺激的细胞因子产生的功能调节因子进行了全基因组筛选。

“我们优化了慢病毒方法，以实现将CRISPRa机器高效且可扩展地递送至原代人类T细胞中。该平台使我们能够进行全基因组汇集CRISPRa筛选，以发现细胞因子产生的调节因子。根据CD4+T细胞中内源性白细胞介素2(IL-2)产生水平或CD8细胞中干扰素-γ(IFN-γ)产生水平，通过荧光激活细胞分选至高分箱和低分箱来分离CRISPRa扰动的细胞库+T细胞。命中包括近端T细胞受体(TCR)信号通路基因，表明这些成分的过度表达可以克服信号“瓶颈”并调节刺激和细胞因子的产生。

“使用CRISPRi进行的相互全基因组功能丧失筛选检测到具有关键调节功能的命中，包括CRISPRa遗漏的一些命中。相比之下，CRISPRa还识别出可能不需要的命中，并且在某些情况下在筛选条件下仅以低水平表达。核因子κB(NF-κB)信号通路对IFN-γ产生的调节有力地证明了这一点，其中CRISPRi识别出了所需的TCR–NF-κB信号通路(包括MALT1和BCL10)。CRISPRa选择性地检测到一组也通过NF-kB发出信号的肿瘤坏死因子超家族受体，包括4-1BB、CD27、CD40和OX40。

“在我们的实验条件下，这些受体并不是信号传导所必需的，但在过度表达时可以促进IFN-γ。因此，CRISPRa和CRISPRi相互补充，以全面发现功能性细胞因子调节剂。

“阵列CRISPRa扰动验证了关键命中对CD4+和CD8+T细胞的影响。我们还通过测量一组分泌的细胞因子和趋化因子，评估了个体CRISPRa扰动如何更广泛地重新编程IL-2和IFN-γ之外的细胞因子产生。

“最后，我们开发了一个平台，用于在原代人类T细胞中合并CRISPRa扰动，并结合单细胞RNA测序(scRNA-seq)读数(CRISPRaPerturb-seq)。我们使用CRISPRaPerturb-seq对由70个全基因组筛选命中和对照引起的单细胞状态进行深入分子表征，以揭示细胞因子产生的调节因子如何调节T细胞激活并将细胞编程为不同的刺激响应状态。

“我们的研究展示了在原代人类T细胞中大规模混合CRISPRa和CRISPRi的强大平台。配对的CRISPRa和CRISPRi筛选实现了基因网络的全面功能图谱，可以调节细胞因子的产生。通过阵列表型分析和混合scRNA-seq方法对CRISPRa命中进行跟踪，能够对关键筛选命中进行精确的功能表征，揭示关键扰动如何将T细胞调整到治疗相关状态。未来在原代细胞中进行CRISPRa和CRISPRi筛选可以确定改进的下一代细胞疗法的靶标。”

近年来，Marson和他的同事利用CRISPR的靶向剪刀敲除各种类型人类免疫细胞的基因，包括调节性T细胞和单核细胞。他们的研究结果已经开始阐明如何设计免疫细胞以更有效地抵抗感染、炎症或癌症。但他的团队知道他们仍然遗漏了故事的一部分。

“敲除基因对于了解免疫细胞功能的基础知识非常有用，但仅敲除的方法可能会错过一些真正关键的基因，”马森实验室的博士后学者、共同第一人ZacharySteinhart博士说。新论文的作者。

特别是，敲除一个基因并不能告诉你，如果你让这个基因变得更加活跃，会发生什么。因此，研究人员转向了CRISPRa，即CRISPR激活的缩写。在CRISPRa中，Cas9蛋白被改变，使其无法再切割DNA。相反，科学家可以将激活剂(一种分子“开启”开关)附加到Cas9上，这样当它与基因结合时，就会激活它。或者，他们可以在Cas9上附加一个阻遏物(一个“关闭”开关)来关闭基因，从而实现类似于典型的敲除方法(称为CRISPRi，用于CRISPR干扰)的结果。

绘制T细胞基因图谱

T细胞是人体免疫的关键介质之一;它们不仅针对入侵的病原体，还指导其他免疫细胞增加或减少对入侵者或癌细胞的反应。这种信息传递是通过细胞因子的产生来实现的。不同类型的T细胞产生不同的细胞因子库，不同的细胞因子或细胞因子混合物对免疫反应有不同的影响。

Marson说，控制T细胞细胞因子将为在各种不同疾病背景下重塑整个免疫反应提供新的机会。但研究人员对于哪些基因控制哪些细胞因子的确切了解并不完全。

在这项新研究中，Marson、Steinhart和共同第一作者RalfSchmidt医学博士与他们的同事合作，使CRISPRa和CRISPRi在原代T细胞中高效工作——这是以前从未做过的事情。

Marson解释道：“将CRISPRa或CRISPRi机器传递到细胞中的效率提高对于实现全基因组实验和加速发现至关重要。”

然后，研究小组使用这些方法激活或灭活直接从多名健康志愿者身上分离的人类T细胞中的近20,000个基因。他们筛选了所得细胞中细胞因子产生的变化，并定位了数百个作为关键细胞因子调节因子的基因，其中包括一些以前从未在敲除筛选中发现的基因。

“我们的工作证明了这项技术在人类T细胞中的精确性和可扩展性，”施密特指出。“我们很快就了解了可以打开哪些基因来调节某些细胞因子水平的规则。”

更好的T细胞疗法

为了治疗某些癌症类型，临床医生越来越多地使用CAR-T细胞疗法，即从患者体内取出T细胞，在实验室中对癌细胞进行改造，然后重新注入。例如，通过改变细胞因子的产生来增强T细胞对抗癌症的能力，可以使CAR-T细胞疗法更加强大。

“我们的新数据为我们提供了极其丰富的T细胞指导手册，”Marson说。“现在我们有了一种基本的分子语言，可以用来设计T细胞，使其具有非常精确的特性。”

Marson的实验室目前正在研究他们筛选中发现的一些单个基因，并致力于进一步利用CRISPRa和CRISPRi来发现控制人类免疫细胞其他关键性状的基因。

“通过与格莱斯顿-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所、创新基因组研究所和加州大学旧金山分校生活治疗计划合作，我们的团队现在希望使用我们的新指导手册来创建合成基因程序，这些程序可以通过CRISPR工程改造到下一代细胞中。免疫疗法可以治疗多种疾病，”Marson说。

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