感谢加州大学圣地亚哥分校科学家领导的国际努力，两种关键的测序技术不再相互矛盾。研究人员开发了一个名为Greengenes2的参考数据库，可以比较和组合来自16S核糖体RNA基因扩增子(16S)或鸟枪法宏基因组测序技术的微生物组数据。

“这是微生物组研究的一个重要时刻，因为我们有效地挽救了十多年来的16S数据，否则这些数据可能在现代鸟枪测序世界中变得过时，”儿科教授RobKnight博士说加州大学圣地亚哥分校医学院、生物工程和计算机科学学院、加州大学圣地亚哥分校雅各布斯工程学院。“这两种方法的结果标准化将显着提高我们发现健康和疾病微生物组生物标志物的机会。”Knight是该团队在《自然生物技术》上发表的论文“Greengenes2将微生物数据统一在一个参考树中”的高级作者，该论文介绍了Greengenes2。

微生物组研究取决于科学家识别样品中存在哪些微生物的能力。为此，他们对样本中的遗传信息进行测序，并将其与列出哪些序列属于哪些生物体的参考数据库进行比较。16S和鸟枪测序是微生物组研究中最广泛使用的两种技术，但它们通常会产生不同的结果。“……使用这些不同方法的研究人员通常会发现他们的结果很难协调，”作者写道。“方法之间缺乏标准化，限制了微生物组在可重复生物标志物发现方面的效用……一个关键问题是全基因组资源和rRNA资源依赖于不同的分类学和系统发育。”

最初的Greengenes数据库已在微生物组领域广泛使用了十多年。它是许多著名项目使用的参考数据库，包括美国国立卫生研究院人类微生物组项目、美国肠道项目、地球微生物组项目等。

然而，其基本局限性之一是它依赖于单个基因16S的序列来识别样本中的生物体。这种经过充分研究的基因长期以来一直被用作分类标记，每种生物体都有自己的16S“条形码”。该方法可以以属级分辨率描述微生物组样本的内容，但它不能总是识别特定的微生物物种或菌株，这对于临床工作很重要。

现代微生物组研究已转向使用鸟枪法测序，即观察整个生物体基因组的DNA，而不是只关注一个基因。这种强大的方法为研究人员提供了更多的物种水平特异性，并提供了对微生物功能的深入了解。“一个关键问题是全基因组资源和rRNA资源取决于不同的分类学和系统发育，”作者继续说道。“微生物组科学被描述为存在可重复性危机，但这个问题很大程度上源于不兼容的方法……例如，生命之网(WoL)和基因组分类数据库(GTDB)提供的全基因组树仅覆盖一小部分已知的细菌和古细菌，而SILVA和Greengenes更全面，但通常与基因组记录无关。”

因此，虽然科学家可能将这两种技术之间的差异归因于实验室制备样品的方式差异，但新研究表明，这两种技术之间的不兼容性源于计算的差异。

更好的参考数据库可以从两种方法中得出相同的结论。这解决了微生物组研究可重复性的一个重要问题，并允许在旧研究中重复使用数百万个样本的数据。Knight和同事指出，“我们推断，迭代方法可以产生一个单一的大规模参考树，统一这些不同的数据层(例如，基因组和16SrRNA记录)，我们称之为Greengenes2。”

为了解决这些不兼容性，研究人员首先扩展了生命之网全基因组数据库。然后，他们使用与合著者、加州大学圣地亚哥分校雅各布斯工程学院副教授SiavashMirarab博士开发的几种新计算工具，将现有的高质量全长16S序列整合到全基因组系统发育中。利用Mirarab团队开发的另一种机器学习工具，他们放置了来自超过300,000个微生物组样本的16S片段。结果是一个广泛的参考数据库，16S和鸟枪法测序数据都可以映射到其中。

为了确认Greengenes2是否有助于标准化这两种测序技术的结果，研究人员从相同的人类微生物组样本中获取了16S和鸟枪法测序数据，并在Greengenes2系统发育的背景下对它们进行了分析。两种技术的结果显示出高度相关的多样性评估、分类概况和效应大小——这是研究人员以前从未见过的。研究小组表示：“通过将序列插入全基因组系统发育，我们表明，当使用同一棵树进行分析时，从相同样本生成的16SrRNA和鸟枪法宏基因组数据在主坐标空间、分类学和表型效应大小方面是一致的。”

“通过Greengenes2，现在可以将巨大的16S数据存储库重新纳入其中，甚至可以在新的荟萃分析中与现代霰弹枪数据相结合，”McDonald说。“这是提高微生物组研究的可重复性和增强医生从微生物组数据中得出临床结论的能力方面向前迈出的重要一步。”

作者进一步得出结论：“总而言之，这些结果表明，使用一致、综合的分类资源可以极大地提高使用不同数据类型的微生物组研究的可重复性，并允许在不同人群中可靠地恢复大效应与小效应的变量。”

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