奥地利科学院分子生物技术研究所(IMBA)和苏黎世联邦理工学院的研究人员开发了一种新型单细胞脑类器官筛选系统，以帮助识别自闭症背后的基因突变、脆弱细胞类型和基因调控网络谱系障碍(ASD)。这个新系统被称为CRISPR-人类类器官-单细胞RNA测序(CHOOSE)，将大脑类器官技术与基于CRISPR的遗传靶向相结合，使科学家能够在单细胞水平上并行全面测试多个突变的影响。人脑类器官。

研究人员表示，他们的新技术为自闭症谱系障碍(ASD)提供了无与伦比的见解，自闭症谱系障碍是最复杂的人类大脑疾病之一，其意义可能为临床研究带来希望。研究负责人、IMBA科学主任JürgenKnoblich博士建议，CHOOSE系统也可以转移到其他疾病领域的研究。“我们预计我们的技术将广泛应用于大脑类器官之外的领域，以研究各种与疾病相关的基因。”Knoblich是该团队在《自然》杂志上发表的论文的共同通讯作者，该论文的标题是“单细胞大脑类器官筛选识别自闭症的发育缺陷””。该团队在论文中得出结论：“通过采用混合CRISPR筛选系统并结合验证，我们的研究为ASD基因功能丧失研究提供了发育和细胞类型特异性表型数据库。”

人类大脑的发育依赖于人类独特的过程，使我们能够构建错综复杂的分层和连接的皮层。然而，作者表示，确切的机制和途径尚未完全了解。“这些过程是由精确且高度精心策划的遗传和分子程序控制的，其中许多程序仍然难以捉摸。”人类大脑发育中的这些独特过程也使人类更容易出现神经发育障碍。例如，许多基因赋予患自闭症谱系障碍的高风险，这对于皮质发育至关重要。尽管临床研究已经表明多种基因突变与自闭症之间存在因果关系，但研究人员仍然不明白这些突变如何导致大脑发育缺陷和神经发育障碍(NDD)。更远，研究人员指出，“……许多NDD，例如自闭症谱系障碍(ASD)，只有在出生后大脑发育几乎完成时才能被诊断出来……分析人类背景下与ASD相关的发育和细胞类型特异性缺陷至关重要但通常仅限于神经影像学和死后组织研究。”而且由于人脑发育的独特性，动物模型的用途有限。“只有人类大脑模型才能概括人类大脑的复杂性和特殊性，”诺布里奇说。当大脑发育几乎完成时……分析人类背景下与ASD相关的发育和细胞类型特异性缺陷至关重要，但通常仅限于神经影像学和死后组织研究。”而且由于人脑发育的独特性，动物模型的用途有限。“只有人类大脑模型才能概括人类大脑的复杂性和特殊性，”诺布里奇说。当大脑发育几乎完成时……分析人类背景下与ASD相关的发育和细胞类型特异性缺陷至关重要，但通常仅限于神经影像学和死后组织研究。”而且由于人脑发育的独特性，动物模型的用途有限。“只有人类大脑模型才能概括人类大脑的复杂性和特殊性，”诺布里奇说。

Knoblich的IMBA实验室和苏黎世联邦理工学院的BarbaraTreutlein博士实验室的研究人员开发了一种技术来筛选与自闭症相关的一整套关键转录调节基因。这一发展尤其具有影响力，因为可以在单个嵌合类器官中同时检查感兴趣的基因，从而释放了在人体组织中进行复杂、高效和便捷的基因筛查的能力。

在CHOOSE系统中，类器官中的每个细胞最多携带一个特定ASD基因的突变。这使得在单细胞水平上追踪每个突变的影响并绘制每个细胞的发育轨迹成为可能。“通过这种高通量方法，我们可以系统地灭活一系列致病基因，”该研究的第一作者、共同通讯作者、Knoblich小组的博士后研究员ChongLi博士说。“随着携带这些突变的类器官生长，我们分析了每种突变对每种细胞类型发育的影响。”

利用CHOOSE系统，研究人员发现，已知使携带者处于自闭症高风险中的36个基因的突变会导致发育中的人类大脑中特定细胞类型的变化。他们发现了通过通用基因调控网络(GRN)调控的关键转录变化。他们写道：“利用单细胞多组学数据，我们构建了大脑类器官的发育基因调控网络(GRN)，并识别了与因遗传扰动而失调的基因相关的富含ASD的调控中枢。”Li解释说，GRN是一组分子调节因子，它们相互作用以控制特定的细胞功能。“我们证明，在大脑发育过程中，某些细胞类型比其他细胞类型更容易受到影响，并确定了最容易受到自闭症突变影响的网络。”

“通过这种方法，我们了解到导致自闭症的基因具有一些共同的分子机制，”诺布里奇补充道。然而，这些共同的机制可能会在不同的细胞类型中产生明显不同的效果。“某些细胞类型更容易受到导致自闭症的突变的影响，尤其是一些神经祖细胞——产生神经元的创始人细胞。事实上，自闭症的病理学可能在大脑发育的早期就已经出现。这表明，在未来研究自闭症基因时，某些细胞类型将需要更多的关注。”李评论道。

在这36个基因中，对ARIDIB基因的干扰被发现具有特别重要的意义。为了确认他们的发现是否与人类疾病相关，研究人员与维也纳医科大学的临床医生合作，利用来自两名具有ARIDIB突变的不同患者的干细胞样本生成了大脑类器官。“在36个基因中，细胞类型组成最显着的变化之一是在ARID1B的背景下发现的，”该团队评论道。“具体来说，干扰ARID1B会扩张腹侧放射状胶质细胞，并增加它们向早期少突胶质细胞前体细胞(OPC)的转变，这是我们在ARID1B患者来源的诱导多能干细胞(iPS细胞)系生成的脑类器官中验证的一种表型。”科布利奇补充道，“两名患者产生的类器官显示出与特定细胞类型相关的明显发育缺陷。我们可以通过将类器官结构与其中一名患者大脑的产前MRI进行比较来验证这些体外观察结果。”这一发现表明类器官数据与临床观察结果非常吻合。

并行突变多个基因并跟踪其影响会产生大量数据。为了分析这个复杂的数据集，共同通讯作者Treutlein和她在苏黎世联邦理工学院的团队使用了定量生物信息学和机器学习方法。“使用这种高通量的单细胞表达数据，我们可以量化给定的细胞类型是否由于给定的突变而更加丰富或更少，并且我们还可以识别通常或明显受每个突变影响的基因组。通过比较所有基因突变，我们可以重建这些与疾病相关的遗传扰动的表型景观，”Treutlein解释道。

研究人员表示，CHOOSE系统代表了致病基因研究的重大进展，使科学家能够获得一种多功能、高通量的方法，可以应用于任何疾病和任何人类模型系统。重要的是，与传统的遗传功能丧失方法相比，CHOOSE大大加快了分析速度。“我们可以在一次实验中看到每个突变的结果，因此与传统方法相比，我们使用了几十年来只能在果蝇等生物体中实现的方法，从而大大缩短了分析时间，”Knoblich解释道。“此外，我们仍然可以从一百年来有关致病基因的科学文献中受益。”

作者指出，“在特定患者的背景下将高内涵扰动筛选和验证相结合，证明了使用类器官系统来研究NDD的有效性。”在注意到他们报告的研究的局限性的同时，研究人员表示，“以系统、可扩展和有效的方式确定细胞类型特异性对遗传性疾病的贡献的能力将极大地增强我们对疾病机制的理解。”

除了获得对自闭症病理学无与伦比的见解外，该团队还强调了CHOOSE系统的多功能性和可移植性，该系统为科学家和临床医生提供了强大且精确控制的高通量筛选工具，可大大缩短分析时间并提供对疾病的宝贵见解机制。

正如作者总结的那样，“我们的研究为类器官模型中疾病易感基因的高通量表型表征铺平了道路，其中包括细胞状态、分子途径和基因调控网络读数……由于CHOOSE系统提供了强大、精确控制的筛选策略，我们预计它将广泛应用于大脑类器官之外的疾病相关基因研究。”

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